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    關于阿斯匹林類藥物和α┐晶體蛋白保護酯酶的失活

    來源:網絡  時間:2017-07-01 15:39:00

       【關鍵詞】 布洛芬
      關鍵詞: α-晶體蛋白;阿斯匹林;布洛芬;酯酶;糖化;氨甲酰化;類固醇
      
      摘 要:目的 研究阿斯匹林類藥物和α-晶體蛋白對酯酶的保護作用. 方法 凝膠色譜分離牛α-晶體蛋白,酯酶分別與糖類、磷酸糖、氰酸钾和激素加阿斯匹林(Asp)、布洛芬(Ibu)、撲熱息痛(Para)和α-晶體蛋白溫育,采用分光光度法測定酶活性. 結果 糖化、氨甲酰化和類固醇誘導酯酶失活的作用呈濃度依賴性,類固醇失活效應最快.10mmol L-1 Asp可部分保護果糖和類固醇誘導酯酶的失活,盡管Ibu抑制酶活性,但其羧基化(Ibu-1)和羥基化(Ibu-2)代謝物有保護作用.α-晶體蛋白與酯酶摩爾比為1 1時,可完全特異地保護果糖、果糖6-磷酸和泼尼松龍-21-半琥珀酸誘導的酯酶失活;而在1 4時,保護率分别為67.0%,55.0%和38.3%. 結論 Asp和Ibu保護酯酶免于失活的作用機制可能不同;α-晶體蛋白作為分子伴侶可保護酯酶免于失活.
      
      Keywords:α-crystallin;aspirin;ibuprofen;esterase;glyca-tion;carbamylation;steroid
      
      Abstract:AIM To investigate the protection effect of as-pirin-like drugs andα-crystallin on inactivation of esterase by glycation.METHODS Bovineα-crystallin was isolated by gel chromatography.Esterase were incubated with sugars,sugar phosphate,potassium cyanate and steroid or with as-pirin,ibuprofen,paracetamol andα-crystallin respectively.The enzyme activities were assayed by the spectropho┐tometer.RESULTS Inactivation of esterase was induced by glycation,carbamylation and steroid in a concentration-dependant manner.Steroid displayed a more rapid inactiva-tion effect than others.10mmol L-1 Aspirin partially pro-tected esterase against inactivation by fructose and steroid.Although Ibuprofen inhibited esterase,its carboxylated(I)and hydroxylated(II)metabolites showed a limited protec-tion.α-Crystallin fully protected esterase against inactivation by fructose,fructose6-phosphate and prednisolone-21-hemisucciate at a molar ratio of1 1,but only to the extent of67.0%,55.0%and38.3%of activity at a molar ratio of1 4respectively.CONCLUSION Aspirin and ibuprofen may play a different role in protection enzymes against inactiva-tion.α-Crystallin acts as a molecular chaperone to protect es-terase against inactivation.
      
      0 引言
      
      臨床流行病和實驗研究表明阿斯匹林類藥物作為非甾體類抗炎藥,可预防和治療白內障等一類結構性疾病(conformational disease).α-晶體蛋白分子伴侶(molecular chaperone)功能的發现,為白內障發病機制的研究提供了新的理論依据.糖化、氨甲酰化和长期大量應用激素等是白內障發病的主要危險因素[1-3] .酯酶具有重要的生理功能,糖尿病患者、實驗性大鼠血漿及老年性白內障晶狀體中酯酶活性下降,可能在糖尿病并發癥和老化病程中起重要作用[4-7] .我們通過觀察阿斯匹林類药物和α-晶體蛋白對酯酶的保护作用,探討白內障的發病机制和潛在的治療途徑.
      
      1 材料和方法
      
      1.1 材料 酯酶(猪肝臟羧酸酯酶EC3.1.1.1)、核糖、果糖、6-磷酸葡糖(G6P)、果糖6-磷酸、葡萄糖、氰酸鉀、潑尼松龙-21-半琥珀酸(P-21-H)、阿斯匹林(Asp)、布洛芬(Ibu)和扑熱息痛(Para)、牛血清白蛋白和雞蛋溶菌酶等均為Sigma公司產品.Ibu的兩種主要代謝物2-[4(2-羧丙烷基)苯基]丙酸菌素酸(Ibu-1)和2-[4(2-甲基-2-羥丙烷基)苯基]丙酸菌素酸(Ibu-2)由Shyadehi等[8] 提供.凝膠柱Sephacryl S-300HR为Phamacia公司产品.
      1.2 方法
      
      1.2.1 α-晶體蛋白分離和純化[9] 8只1.5歲新鲜牛透明晶狀體去囊膜,分離皮質和核,勻漿(0.05mol L-1 磷酸鈉緩沖液、0.2mol L-1 KCl,1mmol L-1 EDTA,1mmol L-1 EGTA;pH6.7),混合物以22440g離心40min.采用凝膠柱Sephacryl S-300HR分離晶狀體結構蛋白(凝膠柱100cm×2.3cm,流速25mL h-1 ),根據色譜圖分別收集αH ,αL ,βH ,βL 和γ-晶體蛋白,透析24h,低溫冷凍干燥,-20℃儲存備用.SDS-PAGE檢測α-晶體蛋白的純度.
      
      1.2.2 酶溫育和活性測定[7] 酯酶(5IU,30.3μg)溶解于50mmol L-1 磷酸鈉緩沖液(pH6.8),首先與果糖(0.45,0.9,5,10和20mmol L-1 )溫育,其中20mmol L-1 為糖基化适宜濃度,并分別與20mmol L
    -1 的核糖、G6P、葡萄糖、果糖6-磷酸(5,10和20mmol L-1 );氰酸鉀(10,20,50和100mmol L-1 ),P-21-H(1,2,5和10mmol L-1 )混合并通過0.2μm微孔過濾器,分裝于消毒小玻璃瓶,37℃水孵箱振動溫育1~13d.酶活性測定以酯酶催化p-硝基苯醋酸(PNPA)的水解率來表示.首先將PNPA溶解于乙腈中配成60mmol L-1 的儲備液,以防止水解.1mL的PNPA與50mmol L-1 磷酸鈉緩沖液(pH6.8)19mL混合,取1mL稀釋液與0.2mL酶溶液混合于1.4mL的比色杯中,28℃下,通過檢測100s內400nm光吸收酶水解降率來測定酯酶的活性[7] .
      
      1.2.3 阿斯匹林类藥物與酯酶的溫育 10mmol L-1 的Asp,Ibu和Para與酯酶混合,分别加或不加20mmol L
    -1 果糖、1mmol L-1 P-21-H和50mmol L-1 氰酸鉀水振動孵育7d;酯酶與10mmol L-1 Ibu,5或10mmol L-1 Ibu-1和Ibu-2混合溫育.第6日,在微過濾前用50mmol L -1 磷酸鈉緩沖液(pH6.8)冲洗1~4次,離心(6000g,5min),并分別檢測酶活性.
      1.2.4 α-晶體蛋白與酯酶的溫育 α-晶體蛋白(3.4,6.7和13.4mg L-1 )和對照蛋白分別與酯酶混合后,加或不加20mmol L-1 果糖、10mmol L-1 果糖6-磷酸、50mmol L-1 氰酸鉀、1mmol L-1 P-21-H,10mmol L-1 Ibu和Para水振動溫育7d,分别檢測酶活性,并與正常對照比较,以百分比表示α-晶體蛋白的分子伴侶活性.
      
      統計學處理:結果均采用Student t檢驗.
      2 結果
      
      2.1 酯酶的穩定性 酯酶(30.3μg)溶解于50mmol L-1 磷酸鈉緩冲液(pH6.8),室溫下放置1d,酶活性穩定;37℃水孵箱振動溫育6和10d,酶活性分別下降(8.2±3.6)%和(9.4±2.8)%.
      
      2.2 糖化誘導的酯酶失活 溫育5d,果糖(0.45,0.9和5.0mmol L-1 )并未明顯導致酶失活.20mmol L-1 果糖和核糖具有快速糖基化作用,溫育2d,殘留酶活性分別為(70.7±4.7)%(P=0.0019)和(60.8±5.7)%(P=0.0099).G6P和葡萄糖為緩慢抑制作用,溫育7d,酶活性分別為(65.7±3.5)%(P=0.0043)和(87.6±5.2)%(P=0.0564);溫育13d,葡萄糖組才有統計學意義(P=0.0039)(Fig1).果糖6-磷酸表现為時間濃度依賴性酶失活效應,溫育3d,10mmol L-1 果糖6-磷酸已使酶失活差異具有顯著性.
      
      圖1 糖化誘導酯酶的失活 略
        
      2.3 氨甲酰化和激素誘導酯酶失活 P-21-H(5和10mmol L-1 )迅速失活酶,甚至1和2mmol L-1 在温育2d時,已顯著失活酶,殘留酶活性分别為(75.6±7.2)%(P=0.0278)和(74.2±3.9)%(P=0.0074)(Fig2).盡管使用較高濃度(20,50和100mmol L-1 ),氰酸鉀對酶失活作用仍較弱.50mmol L-1 氰酸钾溫育2和4d,殘留酶活性分別為(59.4±9.8)%(P=0.0470)和(39.5±4.6)%(P=0.0002).
      
      2.4 Ibu和Para抑制酯酶活性 溫育前10mmol L-1 的Ibu已表現抑制酶活性,與对照比較殘留活性為(46.3±3.2)%(P=0.0012),這種抑制作用進展缓慢;溫育5d,酶活性為(31.7±0.4)%(P=0.0001).溫育6d,過濾后仍保留40.0%的酶活性,沖洗1或4次之間無統計學差異.Para表現為時間依賴性抑制效應,溫育前和溫育1,2和3d,10mmol L-1 的Para使酶活性僅剩余(85.7±8.5)%(P=0.0991),(52.4±3.1)%(P=0.0042),(16.7±5.9)%(P=0.0017)和(10.8±2.2)%(P=0.0002).而10mmol L-1 的Asp溫育5d,并未造成顯著的酶活性丧失.
      
      2.5 Asp,Ibu┐1和Ibu┐2對酯酶的保護作用 Asp,羧化的Ibu-1和羥化的Ibu-2可保護果糖和P-21-H誘導酯酶的失活(Tab1).溫育3d后,10mmol L-1 的Asp保護P-21-H誘導酯酶的失活有顯著性差異(P=0.0024);10mmol L-1 的Ibu-1和Ibu-2分別保護果糖和P-21-H誘導酯酶的失活具有統計学意義. 免費論文下載中心   圖2 氨甲酰化和皮質激素誘导酯酶失活 略

      表1 Asp和Ibu-1/Ibu-2对果糖和P-21-H誘導酯酶失活的保護作用 略
        
      圖3 α-晶體蛋白保護果糖6-磷酸誘導酯酶的失活 略
        
      2.6 α-晶體蛋白保護酯酶的失活 與對照蛋白比較,α-晶體蛋白與酯酶分子摩爾比为1 1時,可特異地完全保護果糖、果糖6-磷酸和P-21-H誘導酯酶的失活,而在1 4時,保護率分別為67.0%,55.0%和38.3%.温育4d時,α-晶體蛋白(1 4)可保護果糖6-磷酸誘導的酯酶失活(Fig3).在溫育3和5d時,P-21-H組酶活性分别為(70.4±2.9)%和(44.5±4.9)%;加α-晶體蛋白(1 4)后,分別為(83.8±7.1)%(P=0.0301)和(75.2±5.3)%(P=0.0038).α-晶體蛋白無保護氰酸钾誘導酯酶失活的作用.α-晶體蛋白(1 2)部分保護Para抑制酯酶的失活,但對Ibu抑制作用無效,盡管溫育5和9d,牛血清白蛋白分別部分保护果糖和果糖6-磷酸誘導酯酶失活,但均無統計學意義.
      
      3 討論
      
      1974年首次報道酯酶存在于晶狀體,并已在人血清中分離出4種類型酯酶,但由于其生理功能復杂,因而作用機制尚不确切.Kamei(1996)从正常人晶狀體可溶性蛋白質中分離純化出两種酯酶,它們有不同的最適pH值、溫度和Km值.其中酯酶Ⅰ的Mr 為200000,酯酶Ⅱ的Mr 為30000.随著老化酶活性顯著下降;老年性白內障晶狀體酯酶活性与正常同齡人比較也明顯降低,提示晶狀體中酯酶活性下降與白内障形成有密切關系[6] .糖尿病患者外周血淋巴細胞和血漿酯酶活性的下降與感染機率的增加有關[4] .糖化、氨甲酰化和激素作為白內障致病因素可誘導酯酶失活,可能是通过與賴氨酸基團N-端游离α-氨基或ε-氨基反應,以降低其電荷.若該反應位于或靠近酶活性位點,可直接失活酶或通過結構性改变間接失活酶[1,10] .晶狀體蛋白周圍存在許多活性小分子,包括糖、來源于尿中的氰酸鹽、糖皮質激素和具有活性的代謝產物等,這些均可在非酶環境下攻擊蛋白質.
      
      糖化是糖的碳基團與蛋白質氨基(通常是賴氨酸或N-端氨基)反應,形成Schiff堿基,進而蛋白質交聯,通過復雜的通路转變成不可逆轉的高級糖化最終产物.本實驗中糖化失活酯酶的程度與其他酶學研究類似[10] ,即糖化強度依次為核糖>果糖>G6P>葡萄糖.英國牛津和印度的流行病調查研究表明,严重的腹瀉是白內障發病的高危因素[2] .腹泻造成血中異氰酸鹽的增高可能是主要原因.異氰酸是氨甲酰化的活性物質,生理性pH條件下,氰酸盐可逆地與蛋白質巰基或不可逆地與氨基(主要是赖氨酸的ε氨基)共價結合.隨著人的老齡化,血中的異氰酸含量逐漸增加.P-21-H的失活作用較糖和氰酸鉀顯著,可能由于潑尼松龍的側鏈有活化的碳酰基和醌-A環,可與蛋白質氨基C-20的活性碳基團反应形成Schiff堿基(類似糖化),并重組為更穩定的加合物有關[10] .本實驗結果表明,阿斯匹林可能通過氨乙酰化作用部分保護果糖和類固醇誘導酯酶的失活.而Ibu抑制酶活性,但其羧基化(Ibu-1)和羥基化(Ibu-2)代謝物有保護作用,Ibu-2的作用略强于Ibu-1,但差異無顯著性,可能是代謝產物增加了其親水性的原因.Ibu是2-手性芳基丙酸的衍生物,主要的代謝物是Ibu-1,有2個非對稱中心和1個立體同質異構體;而Ibu-2有1個非對稱中心和1對鏡像體.尿中含微量1-和2-羥基化Ibu.po Ibu后约80.0%的兩種代謝物以成对或非成對形式存在于尿中[11] .Ibu可減少氰酸鉀和半乳糖與晶体蛋白的結合量[2] ,盡管Ibu和Para與晶體蛋白結合量小,但Ibu的親水性較強,因而其结合緊密.酶學研究提示Ibu和Para無保護類固醇誘导蘋果酸脫氫酶、氨甲酰化誘導6-磷酸葡糖酸脫氫酶和類固醇誘导過氧化氫酶失活的作用,并可抑制延胡羧酸酶和3-磷酸甘油醛脫氫酶[10] .但動物實驗和臨床研究提示阿斯匹林類藥物可防治白內障,它們之間存在不同的保护機制,Ibu和Para可能是通过其藥物前體發揮作用.
      
      α-晶體蛋白作為晶狀體主要的結構蛋白,其分子 伴侶活性表現為在其他蛋白處于易感狀态時,可保護它們免受損傷,主要是抑制各種蛋白質的凝聚和失活.目前認為α-晶體蛋白為非對稱的環形四價聚合體,中央有較大的空洞,表面密度低.在空洞的内或外表面,C-端序列和伸展性的變化是維持α-晶體蛋白伴侶活性的重要因素[10] .本結果提示1分子的α-晶體蛋白可部分保護4分子的酯酶.特異性保護作用可能是通過酯酶或變性的酯酶進入空洞中央,粘附于α-晶体蛋白的外表面而起作用.Harding[1] 提出包括白內障的一类結構性疾病具有相同的病因,就可能存在共同的治療方案.17項流行病學研究表明,若全部老年人應用阿斯匹林類抗炎藥物,約50.0%的Alzheimer’s病可預防.因而阿斯匹林類藥物,具有潛在的治療白內障和Alzheimer’s病等結構性疾病的作用.
      
      致 謝 英國牛津大學眼科醫院Shyadehi AZ和Harding JJ對本研究給予幫助.
      

    參考文獻


      
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